紫外-可見分光光度計基本原理

  1，紫外和可見分光光度計能做什麽(me) ？

• 測定溶液的濃度（含量）

此應用，也叫“定量分析”，是zui常用的。

這是一種方法，通過與(yu) 已知濃度的溶液比較，測定出未知濃度樣品的濃度。

• 測定材料的性質

-例如，夏天在山中或海濱，冬天在滑雪場用的墨鏡、遮光劑化妝品和衣服。當“透射比”被測量時，目標波長是否被真地切斷，是很明顯的。

-每種物質都有其自己的特征“光譜”。通過與(yu) 已知物質的光譜比較，識別未知的樣品。（鑒定）

• 測定分子結構

你知道一個(ge) 物質由分子組成，分子由一組原子組成嗎？每個(ge) 分子有自己的特征光譜（位置，強度等） 。盡管困難，以其光譜為(wei) 基礎的分子結構測定被許多大學和公司實驗室進行。

 2，比色分析

比色分析，又叫做吸光測定法，是根據物質顏色來分析的一種方法。現在，讓我們(men) 看“顏色”是什麽(me) ，“光”是什麽(me) ，哪個(ge) 顯示顏色。

2-1  光和色

2-1-1  光、無線電和 X射線（關(guan) 於(yu) 光）的關(guan) 係

當你被問光是什麽(me) 的時候，你能立即做出回答嗎？包圍我們(men) 的“光” ，是一種電磁波，就像無線電和電視發出的無線電波，X光照片用的 X射線一樣。

 2-1-2  太陽光與(yu) 激光光束的比較  （白光和單色光）

在上頁表中顯示的光的形式中，200-400nm 波長的光叫做紫外（UV） ，從(cong) 400-800nm叫做可見（VIS），從(cong) 800nm到近 1 毫米是紅外（IR）。zui重要的是，僅(jin) 可見光才能被我們(men) 的眼睛看見，並認為(wei) 是一個(ge) “顏色” ，就想它名字那樣。波長決(jue) 定了可見光的顏色：紅、藍等。

這就是彩虹中顏色的順序一直是相同的。

包含所有波長的光，包括紫外，可見光和紅外，叫做“白光” （例如，太陽光，白幟光等） 。另一方麵，光的每種顏色（例如紅、藍等）叫做單色光。太陽光發出的白光通過使用例如“濾光片”或“棱鏡”的工具可被分成 7 種類似彩虹的顏色（波長） 。作為(wei) 對比，激光光束發出的光僅(jin) 包括一種波長（也就是，一個(ge) 單波長）。

★ 白光：包含所有波長的光；單色光：單波長的光

 2-1-3  蘋果為(wei) 什麽(me) 是紅的？  （關(guan) 於(yu) 顏色）

牛頓思考為(wei) 什麽(me) 蘋果從(cong) 數上掉下。

這裏，讓我們(men) 思考為(wei) 什麽(me) 蘋果看上去是紅色的。

晚上在漆黑的房間裏，蘋果看上去是紅色的嗎？回答：不是。但是，同個(ge) 蘋果在燈打開後或大白天顯紅色。這說明我們(men) 需要光（這裏，是白光）來看見“顏色” 。 

為(wei) 什麽(me) 蘋果看上去是紅色的，而不是藍色或黃色？

物質，例如蘋果、汽車和衣服對顏色有偏好，就像我們(men) 一樣。

當某種物質暴露於(yu) 包含各種顏色的光（白光）中時，它吸收，並僅(jin) 從(cong) 光中保持了它zui愛的顏色（一個(ge) 現象叫“吸收”）。  它不喜歡的光（  叫做“補色”）被反射，這樣就形成了我們(men) 眼睛中看到的物質的顏色。

換句話說，蘋果喜歡藍色、綠色，不喜歡紅色。當它暴露於(yu) 白光中時，它會(hui) 吸收藍色和綠色，看上去就像紅色，紅色就是補色。

記住：任何我們(men) 叫“顏色”的東(dong) 西與(yu) “波長”有關(guan) 。

★ 物質吸收特定波長的光。我們(men) 看見的是補色。

 2-1-4  不可見光（紫外和紅外）

從(cong) 目前的闡述看，你知道可見光是什麽(me) 嗎？如果不知道，請溫習(xi) 。

光的形式是什麽(me) ？指像紅外和紫外那樣不可見的，而不是可見光。

• 紫外

紫外光能造成皮膚癌和曬黑。紫外光，簡稱紫外，參見電磁波，波長範圍從(cong) 約400nm（上限）到約 100nm（下限） ，盡管定義(yi) 不是那麽(me) 嚴(yan) 格（幾十 nm或以下的叫做軟 X-射線）。在光譜分析領域，200nm或以下的紫外區叫遠紫外，300nm或以上的叫做近紫外。

通常，紫外和可見分光光度計能測量200nm開始的波長。

• 紅外

我們(men) 經常聽到這個(ge) 詞， “紅外”在日常生活術語中經常使用，例如遠紅外烤架。紅外線指電磁波，波長範圍從(cong) 1毫米起（上限；注意：該範圍的一部分與(yu) 微波的次毫米波重疊）到約 800nm（下限） 。由於(yu) 紅外線有熱效應，它也叫做熱射線。這就是為(wei) 什麽(me) 紅外線用於(yu) 烤架的原因了。

盡管紅外線的分類有很多，通常波長 2.5um 及以下叫做近紅外，2.5-25um 波長叫紅外，大於(yu) 25um波長的叫遠紅外。 盡管紅外分光光度計用於(yu) 紅外測量，一些紫外和可見分光光度計甚至可以測量近紅外區域的光。

 2-2 忽略清潔會(hui) 增加吸光率（朗伯-比耳定律）

你喜歡熱帶魚嗎？盡管它們(men) 很可愛，但打掃魚缸是很麻煩的事，不是麽(me) ？

A和B養(yang) 魚。A很愛幹淨，熱帶魚的魚缸總是很幹淨、清晰。相反，B很懶惰，魚缸總是渾濁的。 他們(men) 的魚缸放在靠窗的地方。由於(yu) A 的魚缸裏的水很幹淨，從(cong) 窗口射進來的大部分光可以通過魚缸看見。然而，B的魚缸的水很渾濁，很少有光透過魚缸。從(cong) 窗口進來的光透過魚缸的比率稱為(wei) “透射比”（T）。

“透射比” （%T）  通常以百分比形式表示。相反地，從(cong) 窗口射進來的光被魚缸裏的水吸收的比率叫做“吸光率”（Abs）.

忽略清潔的魚缸裏渾濁的水吸收更多的光來阻擋其路徑，增加吸光率，降低透射比。另一方麵，魚缸裏幹淨的水能很好地傳(chuan) 輸光，其透射比接近 100%，吸光率幾乎為(wei) 零。

我們(men) 用數學公式來解釋這個(ge) 理論。透射比為(wei) I/I0，I0是從(cong) 窗口進入的光，I是穿過魚缸的光。另外，透射比為(wei) 10-ecL(公式 1)，L是魚缸的寬度（光學路徑長度），c是缸內(nei) 水的渾濁度（濃度），e是常數（叫做“分子吸收常數” ） ，是物質*的（在這個(ge) 例子中，物質產(chan) 生了渾濁） 。由於(yu) 吸光度是透射比倒數的對數，可由公式三表示，它與(yu) 分子吸收係數，濃度和光學路徑長度成正比。該公式稱為(wei) 朗伯-比耳定律。

 2-3  顏色密度的測量（定量分析）

定量分析是一種分析方法，來測定某種物質（溶液）的含量。比如，我們(men) 每天喝的水包含金屬，微量殘留農(nong) 藥，有機物等。但我們(men) 無法目測來測定其含量。

通常，在吸光測定法中，著色試劑被添加至標本，由於(yu) 與(yu) 目標物質的反應產(chan) 生的顏色程度可被觀察到。事先準備標準溶液和標本（樣品） ，然後添加著色劑，使目標物質被染色。樣品的濃度是通過使用校正曲線，比較標準溶液和樣品的吸光度來測定的。

讓我們(men) 看一下測量自來水中的鐵的步驟，作為(wei) 例子。

2-3-1  樣品和標準溶液

為(wei) 了測量物質的濃度，通過將要測試的未知濃度標本（樣品）與(yu) 1 個(ge) 已知濃度的標本（標準溶液）的比較來測定其濃度。當分析自來水中的鐵時，自來水是樣品，已知濃度的鐵溶液是標準溶液。關(guan) 於(yu) 標準溶液，要準備一組不同鐵濃度的溶液。

如果樣品和標準溶液沒有在相同的條件下準備和測量的話，無法獲得正確的結果。例如，樣品是自來水的話，標準溶液應當為(wei) 水溶液，而不是酒精溶液。另外，如果樣品裏添加了酸，它同樣應當添加至標準溶液中。

用於(yu) 溶解物質的液體(ti) ，例如水或酒精被稱為(wei) “溶劑”，在該液體(ti) 中溶解的物質例如鐵，稱為(wei) “溶質” 。如果溶劑和溶質的吸收發生在相同的波長，那就無法獲得正確的結果。

由於(yu) 水在可見和紫外區域沒有吸收，所以它通常被使用。盡管有機溶劑也經常使用，由於(yu) 大部分在紫外區（不是可見區）有吸收，因此使用它們(men) 的時候要小心。 

 2-3-2 魔幻成分（著色劑）

你在觀察自來水的時候，能看見鐵的顏色嗎？  比色分析是分析顏色的一種方法。如果顏色不可見（在可見區域） ，那麽(me) 分析是無法進行的。所以，我們(men) 要做什麽(me) 呢？必要的僅(jin) 僅(jin) 是用魔幻成分給鐵染色。給溶液中目標物質染色的成分叫“著色劑”或“顏色試劑”。

自來水包含的鐵越多，顏色就越深（高吸光度） 。相反，自來水中的鐵越少，顏色越淺（低吸光度） 。由於(yu) 每種成分都準備了不同的著色劑，應當根據分析成分正確使用。

2-3-3  校正曲線

溶液已經配好，現在測量程序要開始了。要測量的波長必須決(jue) 定好。

由於(yu) 這個(ge) 問題在後麵章節光譜中被解釋，讓我們(men) 繼續。下一步是測量標準溶液的吸光度來獲得校正曲線。這裏，水平軸是濃度，縱軸是吸光度。為(wei) 了獲得該曲線，從(cong) 低的鐵濃度向高的鐵濃度的順序測量標準溶液。獲得的濃度和吸光度的值進行繪圖，形成下麵圖表。

這稱為(wei) “校正曲線” 。盡管通常是線性的，如果濃度過低或過高，有可能是二次曲線（曲線向上或向下）。

在通過標準溶液測量而獲得校正曲線以後，測量樣品。在樣品的吸光度測量後，通過與(yu) 校正曲線的比較，可以測定其濃度。請見校正曲線圖。從(cong) 縱軸上的測量吸光度出發，在校正曲線上畫出一條水平線，從(cong) 該水平線的截距上畫一條垂直線。該線上列出的值就是濃度。在定量分析中，樣品的濃度是以這樣的方式決(jue) 定的。 

2-4  觀察顏色（光譜）

2-4-1  光譜是什麽(me) ？

在定量分析中，通過比較物質吸收某波長光的多少來測定濃度的。在其他波長，它吸收多少？“光譜”顯示物質在每個(ge) 波長吸收的多少。

在紫外可見分光光度計中，可以測量發射光譜和吸收光譜。

光譜上的點，橫坐標是波長，縱坐標是透射比或吸光度。請再次記住：在看下麵發射和吸收光譜圖的時候，注意發射和吸收的關(guan) 係。

2-4-2  從(cong) 光譜中能知道什麽(me) ？

盡管鐵的定量分析在前麵的部分執行，哪個(ge) 波長（nm）應當被真實地測量？ 由於(yu) 有較大吸收的波長的靈敏度更高，我們(men) 希望選擇盡可能有zui大吸收的波長。  這與(yu) 吸收譜圖有關(guan) 。請看下麵的譜圖，是添加了著色劑的鐵溶液。該譜圖表明在510nm 附近的吸收是zui大的（zui大吸收處的波長稱為(wei) zui大吸收波長） 。就表明鐵濃度應當在510nm附近測量。

光譜的形狀與(yu) 添加了著色劑的鐵溶液有特別關(guan) 係（淨吸收亮度隨濃度變化）。 如果未知溶液的測量圖譜與(yu) 圖中的光譜一致，就說明樣品是加了著色劑的鐵溶液。物質的特性通過測量其光譜來檢驗。

3  分光光度計的機理

3-1  人和機器的差異（普通機理）

你如何知道一個(ge) 顏色有多厚多薄。就我們(men) 知道的，在紫外和可見波長範圍（200-800nm）中物質能很好地吸收什麽(me) 顏色（波長）？

盡管人類能通過感知物質的顏色或識別顏色的陰影預測總的吸收波長，但無法獲得的波長估計，而且還有個(ge) 體(ti) 差異。另外，人眼無法看見紫外區。

由於(yu) 這個(ge) 原因， “紫外可見分光光度計”係統，沒有個(ge) 體(ti) 差異，能夠測量紫外區。 

在分光光度計中，通過使用人造光源替代陽光，檢測器和表替代人眼來測量顏色（波長） 。與(yu) 人如何看見物質zui大的區別就是：在分光光度計中，白光不是直接照射到物體(ti) ，而是利用棱鏡或衍射光柵將光分成許多顏色，然後每種顏色（單色光）射到物體(ti) 上（掃描）來測量該顏色的特定波長。

*在分光光度計中，白光分成單色光來測量吸收。

3-2  光學係統

3-2-1  有沒有僅(jin) 用於(yu) 樣品的位置？  （單光束和雙光束）

• 單光束係統

在吸收測量中，每次樣品和參比都進行測量和比較。

由於(yu) 在單光束係統中隻有 1 個(ge) 位子用於(yu) 測量， 樣品和參比必須被交換，一個(ge) 100%調節（或0Abs調節）必須被進行，當測量波長變化時。

盡管係統主要用於(yu) 定量測量，小的不貴的係統配置是可以實現的，光源波動（漂移）不能被補償(chang) 。

• 雙光束係統

單光束係統隻有一個(ge) 測量位置，雙光束係統包含的樣品位置和參比位置。由於(yu) 不需要更換樣品和參比（不需要每次測量波長的變化後，100%或 0Abs 的調節），所以它適合定性和定量分析。

3-2-2  小心選擇波長（單個(ge) 單色和雙單色）

掌管場所的人員負責嚴(yan) 格檢查入口的來客，比如“學生禁止進入” 。然而，有沒有學生偷偷進入大廳呢？甚至檢查員很好地檢查了每個(ge) 懷疑的進入者，但還是經常會(hui) 聽到這種情況下有人未經檢查就進入了。

單色（單色器或分光鏡）是一種機器，將需要的波長光從(cong) 含有多波長的光中取出，扮演著在入口檢查光的角色，可以這麽(me) 說。但是，波長，不是要求的波長，會(hui) 混入，盡管有檢查（這個(ge) 混入或損失的光被稱為(wei) 雜散光） 。在進行嚴(yan) 格測試時，該雜散光可能會(hui) 起到壞影響。所以，在雙單色係統中，通過檢查的光被再次檢查。

在單個(ge) 單色係統中，隻檢查一次。 

3-3  分光光度計的部件

3-3-1  光源

兩(liang) 種類型的燈用於(yu) 分光光度計光源：1 個(ge) 氫放電管用於(yu) 測量紫外區，1 個(ge) 鎢燈測量可見/近紅外區域。

3-3-2  分光鏡

分光鏡從(cong) 光源（白光）中選擇單色光（也就是1 個(ge) 波長）。

有 3 種分光鏡：A  過濾型 B棱鏡類型 C  光柵（衍射光柵）類型

3-3-3  樣品池

放樣品的容器通常叫做“池”，由玻璃或石英做成。玻璃池用來測量340nm以上的可見範圍，因為(wei) 它在紫外區波長 340nm或以下幾乎不發射任何光。另一方麵，石英池會(hui) 發射所有波長的光，從(cong) 整個(ge) 紫外到可見區域。然而，由於(yu) 石英池很貴，他們(men) 主要用於(yu) 測量紫外區。

3-3-4  檢測器

檢測器的作用就是將樣品的發射光轉化成電信號。

有多種類型的檢測器，包括 A光電池 B  光電倍增管等